Разрешающую способность метода посева и сроки получения результата

Опубликовано



Учет результатов посева диагностического материала

При выделении культуры кислотоустойчивых микобактерий, отвечающих вышеперечисленным характеристикам, а именно:

— появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее 3-4 недель инкубации;

— наличие колоний характерной морфологии и окраски;

— микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по Ziehl-Neelsen;

следует произвести количественную оценку интенсивности роста.

Интенсивность ростаобозначают по 3-х балльной системе:

(1+) — 1— 20 КОЕ — “скудное” бактериовыделение;

(2+) — 21— 100 КОЕ — “умеренное” бактериовыделение;

(3+) — > 100 КОЕ — “обильное” бактериовыделение.

Регистрируют число КОЕ, выросших на каждой из пробирок с разными питательными средами.

Величина КОЕ (число колониеобразующих единиц) высчитывается как среднее по результатам подсчета числа колоний, выросших на всех пробирках.

Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в компьютерную базу данных полицевого учета.

V. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА
MYCOBATERIUM TUBERCULOSIS

1.ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОМПЛЕКСА
MYCOBATERIUM tuberculosis

Первичная идентификация микобактерий комплекса M. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам:

¾ cскорость роста на плотных питательных средах;

¾ пигментообразование;

¾ морфология колоний;

¾ наличие кислотоустойчивости;

¾ температура роста.

Таблица 5

Культуральные признаки комплекса M. tuberculosis

Культуральные признаки Комплекс M. tuberculosis
Скорость роста Медленнорастущие — > 3 недель
Пигментообразование Цвет слоновой кости
Морфология колоний R или S формы
Наличие кислотоустойчивости Выраженная кислотоустойчивая окраска
Температура роста Оптимальный рост при 35 — 37 0 С

Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении микобактерий туберкулеза может быть сделано опытным бактериологом на основании вышеперечисленных характерных признаков,

подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерий к комплексу M. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов является обязательным

2. ОCНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
M. tuberculosis

К сожалению, не существует какого-либо одного лабораторного метода, позволяющего с достоверностью отличить микобактерии комплекса M. tuberculosis от других кислотоустойчивых микобактерий. Тем не менее, сочетание вышеописанных признаков с результатами ряда приводимых ниже биохимических тестов позволяет провести идентификацию микобактерий комплекса M. tuberculosis с точностью до 95% (см. Таблицу 6).

Для дифференциации микобактерий комплекса M. tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий: M. tuberculosis, M. bovis., M. africanum, M. microti — от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий необходимо применять следующие основные биохимические тесты:

¾ тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);

¾ тест на наличие нитратредуктазной активности;

¾ тест на наличие термостабильной каталазы;

¾ тест на способность наличие раоста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).

В качестве дополнительных можно использовать также следующие тесты:

¾ рост на среде, содержащей 500 мкг/мл пара-нитробензойной кислоты;

¾ рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия.

Для дифференциации M. tuberculosis и M. bovis следует учитывать результаты следующих проб:

— ниациновый тест;

— тест на наличие нитратредуктазы

— тест на наличие пиразинамидазы;

— рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (TCH).

Таблица 6

Тесты для дифференциации микобактерий комплекса M. tuberculosis

Дифференциальные тесты Микобактерии
M. tuberculosis Нетуберкулезные медленнорастущие
Основные биохимические тесты на наличие:
Никотиновой кислоты + —*
Нитратредуктазы + ±
Термостабильной каталазы — +
Рост на среде с натрием салициловокислым (1000 мкг/мл) — +/±
Дополнительные тесты: рост на средах, содержащих:
Паранитробензойную кислоту (500 мкг/мл) — + **
Натрия хлорид 5% — +***

*За исключением M. simae

**За исключением M. gastri

**За исключением M. marinum, M. terrae

Таблица 7

Тесты для дифференциации отдельных видов микобактерий
комплекса M. tuberculosis

Дифференциальные тесты Виды микобактерий комплекса M. tuberculosis
M. tuberculosis M. bovis M. africanum M. microti
Основные биохимические тесты на наличие:
Никотиновой кислоты + — +/ — +/ —
Нитратредуктазы + — — —
Термостабильной Каталазы — — — —/+
Рост на среде с натрием салициловокислым (1000 мкг/мл) — — — —
Дополнительные тесты: рост на средах, содержащих:
Пиразинамид + — + +
Мочевина +/— +/— + +/—
Гидролиз твина в течение 10 дней —/+ —/+ — —/+
ТСН (2 мкг/мл) + — +/— +/ —

Ниациновый тест

Ниацин (производное никотиновой кислоты)играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерии, однако исследования показали, что у M. tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Ниацинотрицательные штаммы M. tuberculosis встречаются чрезвычайно редко. В то же время ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации M. tuberculosis, так как отдельные штаммы M. bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (M. simiae, M. chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию. Это указывает на необходимость при дифференциации выделенных микобактерий не ограничиваться только ниациновой пробой, а по возможности использовать весь рекомендованный выше комплекс реакций.

Принцип метода.Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, поэтому именно эта среда используется для проведения ниациновой пробы. Подлежащая дифференциации культура микобактерий должна быть выращена на среде Левенштейна-Йенсена в течение не менее 3-4- недель и должна иметь достаточно массивный (не менее 50 колоний) рост.

При отрицательном результате реакции следует повторить ее после 6 или более недель инкубации посева, так как возможно, что молодая культура микобактерий не выделила достаточное для реакции количество никотиновой кислоты

При постановке ниациновой пробы необходимо иметь в виду, что M. tuberculosis выделяют продуцируемую ими никотиновую кислоту в питательную среду, на которой они выращиваются. В связи с этим при наличии на поверхности косяка с питательной средой сливного роста микобактерий возможен ложноотрицательный результат реакции, так как экстрагирующий ниацин реактив не всегда может проникнуть в глубь питательной среды. Для облегчения проникновения экстрагирующего реактива в питательную среду необходимо при наличии на ее поверхности сливного роста микобактерий либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность культуры.

Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку.

Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками.

Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичныпри ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Пробу следует проводить только в вытяжном шкафу! Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов.

В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия — вещества более безопасного и доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3-4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.

Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными.

Реактивы для пропитывания бумажных полосок:

Раствор 1. 20% раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты)


В пробирку с 1,75 мл 96 0 этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК.

Смесь подогревают на водяной бане при 56 0 С в течение 5-10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.

Раствор 2. 60% раствор роданистого калия
Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты

( 200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).

Раствор 3. 50% раствор хлорамина «Б»
3,125 г хлорамина «Б» растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56 — 60 0 С при периодическом встряхивании.

Индикаторные бумажные полоски размером 60х80 мм готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке:

— 20% раствор ПАСК — на отмеченный карандашом конец полоски;

— 60% раствор роданистого калия — на середину полоски;

— 50% горячий раствор хлорамина «Б» — на свободный конец полоски.

— Между каплями должны оставаться сухие промежутки.

Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина «Б» на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, затем помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.

Читайте также:  Когда скажут результаты пересдачи

Процедура исследования

¾ Добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий 1 — 1,5 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии сливного роста проткнуть поверхность среды в нескольких местах пипеткой для облегчения доступа раствора к питательной среде;

¾ поместить пробирку в термостат на 2 — 3 часа в полугоризонтальном положении с тем, чтобы жидкость покрывала всю поверхность среды;

¾ вынуть пробирку из термостата и перевести ее в вертикальное положение, позволив жидкости стечь на дно в течение 5 — 6 минут;

¾ в чистую стерильную пробирку перенести пипеткой 0,5 — 0,6 мл экстракта;

¾ индикаторную полоску помеченным карандашом концом, на который нанесена ПАСК, опустить с помощью пинцета в пробирку с экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью средней части полоски, на которую был нанесен роданистый калий;

¾ немедленно закрыть пробирку резиновой пробкой;

¾ оставить при комнатной температуре на 15 — 30 минут; допустимо осторожно покачивать пробирку, пока вся полоска не пропитается экстрактом;

¾ наблюдать за окрашиванием жидкости на дне пробирки на белом фоне.

При положительном ниациновом тесте экстракт окрашивается в желтый цвет разной интенсивности. Любая окраска индикаторной полоски не принимается во внимание, так как это может происходить вследствие окисления реактивов в верхней части полоски. Для дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10% раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым щелочным дезинфицирующим средством.

Источник

Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза Методы обследования на МБТ

Бактериологическая диагностика включает обработку клинического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических гестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий.

Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культуральное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ). автоматические системы (MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESP Culture System и др.), молекулярной генетические методики (PCR. I.CR, NASBA, Q-Bela и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интер­претации полученных результатов.

Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислото­устойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико- диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ведомств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную прогностическую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты.

Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бакгериоскопичсском выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом.

В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое — на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоуетойчивость. в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материапа детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быт ь проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену

Источник

8.1. Техника посева и выделения чистых культур микроорганизмов

Доставляемый в лабораторию материал подвергают бакте­риологическому исследованию в тот же день. Техника посева зависит от характера засеваемого материала, консистенции пи­тательной среды и цели исследования.

Для проведения посевов необходимы: подлежащий исследо­ванию материал, питательные среды, бактериологическая пет­ля, шпатели (стеклянные, металлические), пастеровские и градуированные пипетки, металлические кюветы или поднос для переноса засеянных чашек и металлические коробки для пере­носа пробирок, ведро или бачок с крышками для сброса отра­ботанного инфицированного материала, спиртовая или газовая горелка.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку – «зеркало». Пипетками пользу­ются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериоло­гической петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением мик­робных культур, производят над пламенем горелки. Бактери­альную петлю перед взятием материала прокаливают в пламени горелки, затем ее остужают так, чтобы при соприкосновении с жидкой средой она не вызывала кипения жидкости, а при­косновение к агару не сопровождалось его плавлением. Для остуживания петли лучше всего погружать ее в конденсацион­ную жидкость пробирки со стерильной питательной средой или прикасаться к крышке чашки Петри со стерильной средой. Нельзя остужать петлю прикосновением к поверхности пи­тательной среды, даже свободной от микробного роста, так как на ней могут находиться колонии, не видимые простым глазом.

После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся в ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели, использованные для посевов, опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробир­ках – в верхней трети надписывают название засеянного ма­териала или ставят номер анализа и дату посевов.

8.1.1. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

  • При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если мате­риал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
  • При посеве на скошенный мясопептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой IV и V пальцами, не прикасаясь к той ее части, которая входит внутрь пробирки. Остальные три пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериологической петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После выни­мания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее по­сторонних микроорганизмов из воздуха.

При посеве на скошенный агар петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опус­кают плашмя на поверхность питательной среды и скользящи­ми движениями наносят штрихи снизу вверх от одной стенки пробирки к другой (рис. 8.1).

  • • При посеве на поверхность плотной питательной среды из пробирки в чашки Петри пробирку фиксируют II, III и V пальцами левой руки, а крышку чашки Петри приоткрыва­ют I и IV пальцами левой руки настолько, чтобы в образо­вавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель (рис. 8.2). Небольшое количество исследуемого материала, взятого из пробирки бактериологической петлей, втирают в поверхность питательной среды у края чашки. Затем пет­лю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериологическую пет­лю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поца­рапать ее поверхность, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые пет­лей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов в концевой ее части.
  • • Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользовать­ся вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной сре­ды. Такой характер микробного роста получил название сплошного или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одно­го вида.

  • Для посева материала в толщу плотной питательной среды готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изо­тоническом растворе. Набирают 0,1–1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного за­грязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15–20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40– 45 «С (при такой температуре пробирка со средой, прило­женная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в пи­тательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вра­щают по поверхности стола.
  • Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней матери­алом.
  • Калиброванной бактериологической петлей (диаметр 2 мм, емкость 0,005 мл) производят посев мочи на сектор А чаш­ки Петри с простым агаром, сделав около 40 штрихов. Затем петлю прожигают и производят 4 штриховых посе­ва из сектора А в сектор I, из сектора I в сектор II и из сек­тора II в сектор III, каждый раз после прожигания петли (рис. 8.3).
Читайте также:  Результатом земской реформы александра ii было

Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18– 24 ч, после чего подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, и определяют количество бактерий в 1,0 мл по приведенной табл. 8.1 (этот метод принят для определения степени бактериурии).

Таблица 8.1. Определение количества бактерий в 1 мл методом секторных посевов*

Количество колоний в секторах

Количество бактерий в 1 мл

*Приказ № 535 от 22 апреля 1985 г. «Об унификации микробиологи­ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в кли­нико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учрежде­ний» (Москва, 1985).

8.1.2. Методы выделения чистых культур

Чистой культурой принято называть совокупность однород­ных микроорганизмов, относящихся к одному виду, полученных из массы одной колонии, клетки которой идентичны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, метабо­лическим и генетическим признакам, так как по существующим представлениям микробная колония является популяцией бактериальных клеток, возникшей в результате размножения единственной материнской клетки. Микробная колония являются аналогом клона.

Чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделен­ные из различных источников, могут отличаться друг от друга незначительным отклонением морфологических, культуральных или биохимических признаков, не выходя за пределы своего вида или подвида. Такие культуры называют штаммами. Вместо ранее именованных типов в зависимости от характера изменившегося признака их обозначают морфоварами (отлич­ные по морфологическим признакам), сероварами (имеющие антигенные отличия), биоварами (отличающиеся биологичес­кими свойствами).

Чистая культура необходима для изучения морфологичес­ких, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение полу­чил метод механического разъединения микроорганизмов, на­ходящихся в исследуемом материале, с целью получения изо­лированных колоний на поверхности или в глубине питатель­ной среды. Очень широко применяются селективные питатель­ные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воз­действию определенных факторов внешней среды. Индивиду­альная устойчивость микробов к тому или иному фактору была использована для разработки методов выделения чистых куль­тур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных мик­робов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологичес­кий метод выделения чистой культуры применяется при иссле­довании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43–45 °С. В пробирку вносят одну бактериологическую петлю исследуе­мого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого одну петлю (прокаленную и остуженную) содержимого 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чаш­ки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Рас­плавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливного роста. В пер­вую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и сте­рильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового ма­териала, шпатель переносят во 2-ю, а затем и 3-ю чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чис­той культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют парал­лельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 90°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посе­ва материал, находящийся в петле, расходуется постепенно, и по линиям штрихов, нанесенных в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные ус­ловия, сущность которых заключается в удалении молекуляр­ного кислорода из питательной среды и пространства, окружа­ющего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспе­чивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удале­ния растворенного кислорода является кипячение. Непосред­ственно перед посевом материала пробирки с питательными Средами кипятят на водяной бане в течение 10–20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, уда­ляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду бы­стро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воз­духа, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху сте­рильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1–1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, ас­корбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глутатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приго­товление питательной среды Китта – Тароцци (рецепт 161), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют физи­ческие, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов:

  • • способ Виньяля – Вейона. Берут 4–5 пробирок с 0,5 % рас­плавленным и охлажденным до температуры 40–45 °С са­харным агаром. В содержимое одной из них вносят пипет­кой небольшое количество исследуемого материала и тща­тельно размешивают. Для уменьшения концентрации мате­риала с целью получения изолированных колоний засеян­ную среду в количестве, соответствующем объему внесен­ного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют ка­пилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в мо­мент насасывания ее в пипетки, пока их кончик не обломлен, пипетки погружают на 3–5 мин в стерильную воду с темпера­турой 45–50 °С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2–3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изо­лировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микро­ба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду;

  • • выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные усло­вия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Пет­ри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачива­ют воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуум­ных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Аристовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидро­сульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор закры­вают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 *С на 24–48 ч.

Читайте также:  Результаты русско японской войны 1945 для ссср

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5 % кровяной агар с 1–2 % глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вы­резают стерильным скальпелем канавку шириной 1–1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину – культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палоч­кой (Escherichia coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрыва­ют, а свободное пространство между дном и крышкой закле­ивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстро растущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат – прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях – представляет собой толстостенную металлическую или пласти­ковую камеру с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к вакуум-насосу. Вместо кислорода в нем используются газо­вые смеси.

Источник

Ответы на тест НМО “Микробиологическая диагностика туберкулеза”

1) иммуноферментный анализ;
2) метод биологических микрочипов;+
3) посев на плотные питательные среды, содержащие противотуберкулезные препараты.

2. ВАСТЕС MGIT 960 – это

1) полностью автоматизированная система для роста, детекции и тестов на лекарственную чувствительность M.tuberculosiscomplex;+
2) полностью автоматизированная система для роста, детекции и тестов на лекарственную чувствительность M.tuberculosiscomplex и М.leprae;
3) полуавтоматизированная система для роста и детекции M.tuberculosiscomplex, без возможности проведения тестов на лекарственную чувствительность;
4) полуавтоматизированная система для роста, детекции и тестов на лекарственную чувствительность M.tuberculosiscomplex.

3. Входной контроль реактивов и расходных материалов относится к

1) аналитическому этапу этиологической диагностики;
2) постаналитическому этапу этиологической диагностики;
3) преаналитическому этапу этиологической диагностики.+

4. Ген, в котором происходят мутации, ассоциированные с устойчивостью M. tuberculosis к изониазиду

1) gyrA;
2) katG;+
3) rpoB;
4) rrs.

5. Ген, в котором происходят мутации, ассоциированные с устойчивостью M. tuberculosis к рифампицину

1) gyrA;
2) katG;
3) rpoB;+
4) rrs.

6. Диагностический материал, который берется для исследования на туберкулез у взрослого

1) мокрота, промывные воды бронхов;+
2) промывные воды желудка, промывные воды бронхов;
3) слюна, мокрота;
4) слюна, промывные воды желудка.

7. Доминирующий генотип M. tuberculosis на территории России

1) Beijing;+
2) Haarlem;
3) LAM;
4) Ural.

8. Иммунохроматографический тест культуры с BACTEC MGIT 960 отрицательный означает, что

1) в пробирке не выросли M.tuberculosiscomplex;+
2) получена чистая культура M.tuberculosis;
3) получена чистая культура M.tuberculosiscomplex;
4) смесь культуры M.tuberculosiscomplex и неспецифической микрофлоры.

9. Использование GeneXpert позволяет определить устойчивость МБТ к рифампицину в течение

1) 1 часа;
2) 12 часов;
3) 2 часов;+
4) 24 часов.

10. К основным биологическим особенностям возбудителя туберкулеза, которые делают его устойчивым к внешним воздействиям, относятся все перечисленные, кроме

1) большого содержания липидов;
2) своеобразия строения оболочки микобактерий;
3) среды обитания и способности выработать устойчивость к химиопрепаратам;
4) усиленного размножения.+

11. К этиологическим методам диагностики туберкулеза НЕ относится

1) ПЦР в реальном времени;
2) квантифероновый тест;+
3) метод посева;
4) микроскопия с кислотоустойчивым окрашиванием.

12. Количество мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к фторхинолонам, заложенных в тест-систему «ТБ-ТЕСТ» (ООО «Биочип-ИМБ»)

1) 15;
2) 24;
3) 38;+
4) 9.

13. Критерии роста на среде с противотуберкулезными препаратами для метода абсолютных концентраций

1) появление 1 КОЕ микобактерий туберкулеза на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат в критической концентрации;
2) появление 20 и более КОЕ микобактерий туберкулеза на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат в критической концентрации при обильном росте в контроле;+
3) появление более 10 КОЕ микобактерий туберкулеза на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат в критической концентрации;
4) появление более 5 КОЕ микобактерий туберкулеза на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат в критической концентрации.

14. Метод обнаружения микобактерий, обладающий наименьшей разрешающей способностью

1) ПЦР в режиме реального времени;
2) люминесцентная микроскопия;
3) посев на плотную питательную среду;
4) световая микроскопия.+

15. Микобактерии НЕ являются

1) грамположительным;
2) кислотоустойчивыми;
3) нокардиоподобными;
4) спорообразующими.+

16. Микобактерия туберкулеза может трансформироваться в

1) L-формы;+
2) вирусы;
3) кокки;
4) риккетсии.

17. Микробиологические исследования с целью контроля лечения рекомендуется проводить

1) двукратно;+
2) однократно;
3) трехкратно;
4) четырехкратно.

18. Минимальное количество микобактерий туберкулеза в диагностическом материале может быть выявлено методом

1) люминесцентной микроскопии;
2) полимеразной цепной реакции;+
3) посева на жидкую среду;
4) посева на плотную среду.

19. Минимальное количество полей зрения, обязательных для просмотра при отрицательном результате микроскопического исследования при окраске по Цилю-Нильсену

1) 100;
2) 200;
3) 300;+
4) 400.

20. На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена выросли R-колонии

1) дрожжевые грибы;
2) культура принадлежит к M.avium;
3) культура принадлежит к M.gordonae;
4) культура принадлежит к M.tuberculosiscomplex.+

21. Назовите методы лабораторной диагностики туберкулеза, обладающие наибольшей специфичностью

1) ПЦР-анализ, микроскопия мазка;
2) микроскопия мазка, биопробы;
3) посев на питательную среду, ПЦР-анализ;+
4) посев на питательную среду, микроскопия мазка.

22. Наиболее важной клинически значимой характеристикой микобактерий туберкулеза является

1) массивное бактериовыделение;
2) наличие МБТ птичьего и бычьего типов;
3) наличие лекарственной устойчивости;+
4) наличие микобактерий в виде L-форм.

23. Наиболее важной клинической характеристикой микобактерий туберкулеза в диагностическом материале больных является

1) массивное бактериовыделение;
2) наличие МБТ птичьего и бычьего типов;
3) наличие лекарственной устойчивости;+
4) наличие микобактерий в виде L-форм.

24. Нетуберкулезные микобактерии могут вызвать у человека

1) альвеолит;
2) микобактериоз;+
3) пневмонию;
4) саркоидоз.

25. Окраска микобактерий по Цилю-Нильсену основана на

1) кислотоустойчивости микобактерий туберкулеза;+
2) спиртоустойчивости микобактерий туберкулеза;
3) термостабильности микобактерий туберкулеза;
4) щелочеустойчивости микобактерий туберкулеза.

26. Основная причина ложноположительных результатов ПЦР-анализа

1) ингибиторы в клиническом материале;
2) контаминация;+
3) не правильно подобранная тест-система для выделения ДНК;
4) реактивы с истекшим сроком годности.

27. Основным признаком, позволяющим отличить микобактериальные популяции от других бактерий является

1) медленный рост на питательных средах;
2) спирто- и кислотоустойчивость;+
3) способность формировать особого вида колонии.

28. Положительный результат ПЦР на наличие маркера IS6110 позволяет сделать заключение о наличии в образце

1) ДНК M. avium;
2) ДНК M. tuberculosiscomplex;+
3) ДНК Mycobacteriumspp;
4) жизнеспособных клеток M. tuberculosiscomplex.

29. При использовании системы Bactec посев производится

1) на питательную среду Левенштейна-Йенсена;
2) на питательную среду Миддлбрука 7Н9;+
3) на питательную среду Финна-I;
4) на питательную среду Финна-II.

30. При обнаружении методом микроскопии 10 КУМ в 1 поле зрения, результат исследования обозначается как

31. Проведение ПЦР-анализа начинается с этапа

1) амплификации ДНК-фрагментов;
2) выделения ДНК;+
3) гибридизации ДНК-продуктов амплификации;
4) детекции ДНК-продуктов амплификации.

32. Разрешающая способность культурального метода исследования

1) 1-10 МБТ в 1 мл патологического материала;
2) 10-100 МБТ в 1 мл патологического материала;+
3) 100-1000 МБТ в 1 мл патологического материала;
4) 5000-10000 МБТ в 1 мл патологического материала.

33. Разрешающая способность метода ПЦР в режиме реального времени

1) 1-10 МБТ в 1 мл диагностического материала;+
2) 100-1000 МБТ в 1 мл диагностического материала;
3) 11-100 МБТ в 1 мл диагностического материала;
4) 5000-10000 МБТ в 1 мл диагностического материала.

34. Разрешающая способность метода микроскопии

1) 1-10 МБТ в 1 мл патологического материала;
2) 100-1000 МБТ в 1 мл патологического материала;
3) 11-100 МБТ в 1 мл патологического материала;
4) 5000-10000 МБТ в 1 мл патологического материала.+

35. Результат микроскопического исследования 2+ означает, что обнаружено

1) 1-10 КУМ на 1 поле зрения;+
2) 1-9 КУМ на 100 полей зрения;
3) 10-99 КУМ на 100 полей зрения;
4) более 10 КУМ на 1 поле зрения.

36. Рекомендуемое минимальное количество образцов диагностического материала для выявления возбудителя туберкулеза (до начала лечения) составляет

1) 1;
2) 2;+
3) 3;
4) 4.

37. Среднее время появления роста культуры микобактерий туберкулезного комплекса на жидкой питательной среде составляет

1) 10-22 дня;+
2) 2-5 дней;
3) 24-36 дней;
4) 7-14 дней.

38. Среднее время появления роста микобактерий туберкулезного комплекса на плотных яичных средах

1) 1-7 дней;
2) 10-15 дней;
3) 15-30 дней;+
4) 40-60 дней.

39. Тест-система «ТБ-ТЕСТ» (ООО «Биочип-ИМБ») позволяет выявлять мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью

1) к двум препаратам;
2) к пяти препаратам;+
3) к трем препаратам;
4) к четырем препаратам.

40. Туберкулез у человека чаще всего вызывает

1) M. bovis-BCG;
2) М. avium;
3) М. bovis;
4) М. tuberculosis.+

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Источник

Adblock
detector